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糖工程毕赤酵母蛋白表达服务
发布时间:2016-05-19   点击次数:843次

糖工程毕赤酵母表达服务

       毕赤酵母表达系统具有生长快,易于培养,遗传操作简单等特点,同时又具备对蛋白质进行空间折叠,糖基化修饰等能力,能够高水平表达蛋白,因此被认可为一种大规模表达蛋白的强有力的工具,在生物工程领域中具有广阔的应用前景。但是毕赤酵母表达系统的主要缺点是对蛋白的过度糖基化修饰而产生不同与哺乳动物细胞的高甘露糖链,严重影响蛋白的结构和功能,降低生物活性,同时带有高甘露糖链结构的蛋白在体内会引起免疫反应。由于酵母表达系统存在过度糖基化修饰的缺点,使其无法代替哺乳动物细胞表达系统应用于生产各种糖蛋白。因此解决高甘露糖链问题是毕赤酵母糖基化工程改造的核心步骤。  

 

       哺乳动物细胞和酵母在内质网(ER)具有相同的N-糖基化起始步骤及修饰加工过程。在新生肽链的合成过程中,前体寡糖被连接到新生肽链特征序列Asn-X-Ser/Thr(X为除Pro外的任意氨基酸)中的天冬酰胺残基(Asn)上,再加工成 Man8GlcNAc2 糖链结构,随着合成的蛋白转运进入高尔基体,然后哺乳动物细胞和酵母高尔基体对蛋白糖链进行完全不同的修饰加工过程。哺乳动物细胞首先在甘露糖苷酶I的作用下形成 Man5GleNAc2 糖链,然后在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I作用下形成GlcNAcMan5GlcNAc2杂合型糖链。当甘露糖苷酶II进一步去除两个甘露糖形成GlcNAcMan3GlcNAc2时,在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II,半乳糖转移酶和唾液酸转移酶作用下形成一系列复杂型糖链,包括GlcNAc2Man3GlcNAc2,Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,和Sa2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。而酵母在OCH1基因编码的1,6甘露糖转移酶(1,6 MnT,Och1p)的作用下首先生成 Man9GlcNAc2 糖链,从而引发在蛋白糖链上连续添加多个甘露糖,形成不同与哺乳动物细胞的高甘露糖链 Man10-100GlcNAc2(图1)。我们应用基因工程技术对毕赤酵母的糖基化修饰途径进行改造,通过敲除och1基因以及引入甘露糖苷酶,构建了糖工程毕赤酵母表达系统(Glycoengineered Pichia Pastoris),克服了毕赤酵母对蛋白过度糖基化修饰而形成高甘露糖链的缺点,生产的糖蛋白具有均一的低分子糖链。糖工程毕赤酵母这一新型表达系统,综合了大肠杆菌、哺乳动物细胞和酵母三类传统表达系统的优点,同时克服它们的缺点,具有生产周期短、成本低、产量高、易于操作和工业放大等优势,将对蛋白表达和生物制药产生重大影响

 

      

图1:哺乳动物细胞和糖工程毕赤酵母表达蛋白的糖基化修饰

 

                                               

                                                                                                      图 1

      

图2:哺乳动物细胞、酵母和糖工程毕赤酵母表达的蛋白糖链结构

      (A): 哺乳动物细胞表达的蛋白具有人体复杂型糖链结构;

      (B): 毕赤酵母表达的蛋白带有不同与人的高甘露糖链结构;

      (C): 糖工程毕赤酵母表达的蛋白具有与人相近的低分子糖链。           

 

 

 

         A

      B

      C

 

图3:用野生型毕赤酵母与菁因康糖工程毕赤酵母表达的糖蛋白IL-22的糖链结构的质谱分析

        (A):用野生型毕赤酵母表达的糖蛋白IL-22带有不均一的高甘露糖链,Man9-15GlcNAc2(m/z: 1907,2069, 2231,2393,2555,2717,2880);(B):用菁因康糖工程毕赤酵母表达的IL-22带有均一、与人体相配的低分子糖链Man5GlcNAc2(m/z: 1257)。

  
 

 

服务内容
      1、根据客户要求,设计目的蛋白基因序列,添加标签,密码子优化和基因合成;

      2、将目的蛋白基因克隆到毕赤酵母表达载体上进行分泌表达;

      3、对构建的表达载体进行基因测序,确认目的基因序列;

      4、将构建好的表达载体转化到糖工程毕赤酵母宿主菌中;

      5、PCR鉴定阳性转化菌株;

      6、选择阳性转化菌株进行蛋白表达鉴定;

      7、大体积培养菌株,诱导表达目的蛋白;
      8、纯化和检测目的蛋白的浓度与纯度;

      9、根据客户要求对目的蛋白进行分装或冻干。

 

服务优势

糖工程毕赤酵母表达系统与大肠杆菌、哺乳动物细胞和酵母这三类传统表达系统相比,具有许多显著的优势:

      1、表达的蛋白具有特定、均一的糖链结构,克服了酵母高甘露糖链对蛋白结构和功能的影响;

      2、分泌表达的蛋白接近于天然状态,具有生物活性;

      3、生产周期短、成本低、产量高、易于操作和工业放大;

      4、多样化的选择,灵活多变的服务方式;

      5、全面技术服务,保证交付蛋白量及纯度,省心省事省时;

      6、目标基因不表达只收取基因合成费用,保证客户付费能收到需要的蛋白。 

 

服务流程 
     1、如有任何需要,通过电话、邮件或业务人员等多种方式联系我们,我们的服务人员会尽快与您取得联系。

     2、我们需要您填写《蛋白表达服务需求表》,发送至info@genekine.com.cn公司专业技术人员将会与您及时沟通,确认订单,协商制定科学的实验方案。
     
3、订单进行过程中,公司的客服人员会及时向您汇报实验进程。 
     
4、实验结束后,依据签订的合同,向您发送相应的实验报告,您确认验收后发货。

 

 

 

 

        客户提供

         交付标准

      交付时间

    1、目的基因信息
    2、目标蛋白质相关信息
    3、蛋白量、纯度及分装要求
    4、其他具体要求及细节

    1、表达载体的测序结果。

    2、PCR鉴定阳性克隆结果。
    3、蛋白SDS-PAGE验证结果。 
    4、表达纯化的蛋白

4-5周

 

 

 

 

 

 

 

备注说明:蛋白信息包括天然蛋白是否有信号肽,糖基化修饰,等电点pI值;所需蛋白的用途,要求的纯度及标签信息。

 

 

 

 

订单下载:《蛋白表达服务需求表》

邮箱info@genekine.com.cn

电话:  0571-89059592

 

 

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